Esansiyel Uçucu Aromatik Yağlar

Esansiyel uçucu aromatik yağlar

Esansiyel Yağlar

Bu çalışmanın amacı yeni ekstraksiyon teknolojileri kullanılarak Türkiye’de yetişen kekik, defne ve biberiye esansiyel yağlar ının eldesidir. Farklı ekstraksiyon metodları ile elde edilen ürün yağ içeriği ve kompozisyonu açısından karşılaştırılmıştır. Ayrıca, farklı ekstraksiyon metodlarıyla elde edilen uçucu aromatik yağların antioksidan ve antimikrobiyal özellikleri tespit edilmiştir. Bu çalışmada, kekik ve defne için çözgensiz mikrodalga ekstraksiyonu (ÇME) ve biberiye için mikrodalga yardımlı hidrodistilasyon (MYH) kullanılmıştır. Ayrıca, baharatlardan yağ elde etmek için süperkritik akışkan ekstraksiyonu denenmiştir. Kontrol olarak hidrodistilasyon kullanılmıştır. ÇME ya da süperkritik karbondioksit ekstraksiyon metodlarının, hidrodistilasyonla kıyaslandığında daha fazla kekik uçucu yağı verdiği tespit edilmiştir. ÇME ve hidrodistilasyonla elde edilen uçucu esansiyel yağlar ın kompozisyonları dolayısıyla antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteleri arasında önemli bir fark bulunmazken süperkritik akışkan ekstraksiyonu ile elde edilen yağın kompozisyonu farklı bulunmuştur. ÇME yönteminde hidrodistilasyona göre işlem süresi %80 azalmıştır. ÇME ve hidrodistilasyon yöntemleriyle elde edilen defne yağları arasında verim, antioksidan ve antimikrobiyal aktivite bakımından önemli bir fark bulunmamıştır. ÇME yöntemi kullanıldığında işlem süresinin hidrodistilasyona göre % 55-60 oranında kısaldığı görülmüştür. En yüksek verim süperkritik karbondioksit ekstraksiyonunda elde edilirken, en çok oksijenli bileşen miktarı ÇME yöntemi kullanıldığında elde edilmiştir. Biberiye yaprakları suyu yeterince emmediği için ÇME yöntemi bu bitki için başarılı olmamış ve onun yerine MYH metodu kullanılmıştır. Bu metod, hidrodistilasyona göre işlem süresini % 65 oranında kısaltmıştır. MYH metodu ile hidrodistilasyona ve süperkritik akışkan ekstraksiyonuna göre daha fazla oksijenli bileşen elde edilmiştir. MYH metodu ve hidrodistilasyon ile elde edilen biberiye uçucu yağları antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteleri açısından benzerlik göstermiştir. Hidrodistilasyona göre daha kısa sürede daha kaliteli yağ elde edilen çözgensiz mikrodalga ekstraksiyonu kekik ve defne için ve mikrodalga yardımlı hidrodistilasyon biberiye için en uygun ekstraksiyon metodları olarak seçilmiştir.

Esansiyel Yağlar : Kekik, defne ve biberiyenin, gıda, kozmetik ve tıp endüstrisinde önemli bir yeri vardır. Bu baharatlardan elde edilen uçucu yağların yüksek antimikrobiyal ve antioksidan özelliklerinin olduğu bilinmektedir (Akgül ve Kıvanç, 1988; Akgül ve Kıvanç, 1989; Baratta ve ark., 1998; Miura ve Nakatani, 1989; Pintore ve ark., 2002; Saccheti ve ark., 2005). Bu nedenle, ekstraksiyon için ekonomik ve güvenli bir metodun kullanılması önemlidir. Uçucu yağların ekstraksiyonunda konvansiyonel metodlar kullanıldığında bazı aroma bileşenlerinde kayıplar, düşük ekstraksiyon verimi, ısıl etkilerle bazı bileşenlerin bozulması veya üründe çözgen kalıntısı gibi problemler görülmektedir. Mikrodalga ekstraksiyonu ve süperkritik akışkan ekstraksiyonu, çözgen ekstraksiyonu ve hidrodistilasyon metodlarının dezavantajlarını azaltan iki yeni ekstraksiyon metodudur.

Mikrodalga ekstraksiyonu iki şekilde olabilmektedir: çözgensiz mikrodalga ekstraksiyonu ve mikrodalga yardımlı hidrodistilasyon. Çözgensiz mikrodalga ekstraksiyonu yakın bir zamanda geliştirilmiştir. Bu metodda mikrodalga atmosferik basınçta distilasyon ile birleştirilmiştir. Çözgen kullanılmadığı için çevre dostu bir teknoloji olarak kabul edilir. Mikrodalga yardımlı hidrodistilasyonda çözgen olarak hidrodistilasyonda olduğu gibi su kullanılmaktadır. Bu metodların, konvansiyonel metodlarla karşılaştırıldığında değerli uçucu yağ eldesi ve enerji tasarrufu gibi avantajları vardır.

Süperkritik akışkan ekstraksiyonu baharatların ekstraksiyonunda bir başka alternatif metoddur. Düşük çözgen gereksinimi nedeniyle verimli, güvenli ve ucuz bir metoddur. Süperkritik akışkanların hem sıvıların çözgenlik hem de gazların aktarım özelliklerine birarada sahip olmaları, bitkiler gibi difüzyon kontrollü matrislerin ekstraksiyonu için uygun olmasını sağlamaktadır. Bu çalışmada, bu iki ekstraksiyon metodu; Mikrodalga ekstraksiyonu ve süperkritik akışkan ekstraksiyonu kullanılmıştır. Ekstraksiyon aynı zamanda karşılaştırma amaçlı olarak hidrodistilasyonla da yapılmıştır. Farklı ekstraksiyon metodları ve çalışma şartları yağ verimi, kompozisyonu ve antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteleri açısından karşılaştırılmıştır.

Esansiyel Yağlar ve Baharatlar : Baharatlar gıdalara lezzet verici, antimikrobiyal özelliklerinden dolayı koruyucu ve ayrıca antioksidan olarak katılabildikleri gibi insanlar tarafından, tedavi edici özelliklerinden dolayı da yaygın olarak tüketilmektedir (Aktuğ ve Karapınar, 1986). Baharatların gerek patojen, gerekse gıdalarda bozulma yapan mikroorganizmaları da kapsamak üzere birçok mikroorganizma grubunun üremesine, spor jerminasyonuna ve toksin sentezlemeleri üzerine etkilerini içeren çeşitli araştırmalar yapılmıştır (Akgül ve Kıvanç, 1988; Akgül ve Kıvanç, 1989; Aktuğ ve Karapınar, 1986). Baharatların antimikrobiyal etkileri baharat uçucu yağlarında bulunan etken maddelerinden kaynaklanmaktadır. Bitki ve baharatların doğal antioksidan kaynaklar olarak kullanımlarını araştıran çalışmaların sayısı da gün geçtikçe artmaktadır (Dorman ve ark.,1995, Tomaino ve ark., 2005). Bu araştırma alanına yönelik artan ilgi ise bitki ve baharatların gıdalara eklenmesinin insan sağlığı açısından daha güvenilir olarak değerlendirilmesinden kaynaklanmaktadır (El-Massry ve ark., 2002, Tomaino ve ark., 2005). Bitki ve baharatlardaki antioksidan bileşiklerin önemli bir kısmını terpenoid yapıdaki bileşiklerin yanı sıra fenolik bileşikler de oluşturmaktadır. Fenolik bileşikler terimi, bitkilerin ikincil metabolizma ürünlerinin önemli bir kısmını oluşturan ve çok sayıda değişik bileşeni içeren bir grubu temsil eder. Bu bileşikler bitkilerde oluşabilecek çeşitli hasarlara karşı savunma sisteminin bir yanıtı olarak üretilirler. Kimyasal olarak fenolik bileşikler bir ya da birden fazla OH grubu içeren aromatik halkaya sahip olan bileşikler ve bunların fonksiyonel özellik gösteren türevleri olarak tanımlanır. Ancak bu tanımlama, bazı fenolik bileşiklerin, östron gibi terpenoid orjinli cinsiyet hormonu içermesi nedeniyle tam olarak geçerli olmamaktadır. Bu nedenle tanımlamanın metabolik orijin temel alınarak yapılması önerilmektedir (Shahidi ve Naczk, 1995; Robards ve ark., 1999). Gıda bileşeni olarak fenolik bileşikler antimutajenik, antikarsinojenik, antioksidan, antienflamatuar ve antiallerjik özellikleri ile insan sağlığı üzerine olumlu etkileri, tat ve doku oluşumu, renk oluşumu ve değişimi üzerine etkileri, antimikrobiyal aktiviteleri ve bazı enzimleri (o-difenil oksidaz ve y-galaktosidaz vb.) inhibe edici etkileri açısından önem taşımaktadır (Shahidi ve Naczk,1995; Karakaya ve El, 1997; Karakaya ve El, 1999). Son yıllarda yapılan çalışmalar fenolik bileşiklerin antioksidan etkisi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Antioksidan etkinin fenol halkasındaki –OH grubu sayısı arttıkça arttığı ve aynı bileşik için bu etkinin meta-, orto- ve para- sırası ile yükseldiği belirtilmiştir (Acar,1998). Uçucu yağlar ve oleoresinler baharatlara aromasını veren maddelerdir ve aromanın gücü alkaloid miktarıyla ilgilidir. Baharatın antioksidan miktarı, bitkinin hasat zamanına, çeşidine ve iklim koşullarına bağlıdır. Baharatlardan elde edilen yağlar gıda endüstrisinin yanı sıra kozmetik, eczacılık ve bunlarla ilgili diğer endüstrilerde de kullanılan önemli bir maddedir.

Baharatlardan elde edilen uçucu yağlar çok miktarda aroma bileşiği içermektedir. Bileşenler 3 ana grupta toplanmaktadır (Karger ve ark., 1973): (a) (C5H8)n genel formulüne sahip olan hidrokarbonlar; n=2, terpenler; n=3, seskiterpenler; n=4 diterpenler. (b) Hidrokarbonlardan oluşan oksijenli bileşikler, alkoller, aldehitler, ketonlar, fenoller, esterler, eterler. (c) Kükürt yada azot içeren diğer özel bileşikler. Türkiye’de yaygın olarak yetişmesi ve gıda, kozmetik ve medikal endüstrilerinde önemli olmaları sebebiyle bu çalışmada kekik, defne ve biberiye ile çalışılmıştır.

Esansiyel Yağlar : Kekik Kekikte (Origanum vulgare) bulunan en önemli aroma bileşenleri timol, karvakrol, linalol, borneol, kamfen, a-pinen, geraniol ve y-terpinendir. Kekikten elde edilen uçucu yağın lipid sistemleri üzerindeki koruyucu etkisi üzerine literatürde çalışmalar vardır (Farag ve ark., 1989). Kekik yağındaki en önemli fenolik bileşenler karvakrol ve timol olarak tespit edilmiştir (Rhyu, 1979; Bestmann ve ark., 1985; Stahl-Biskup, 1986). Bunlara ilaveten p-simen-2,3- diol’un de önemli derecede antioksidan özellik gösterdiği tespit edilmiştir (Schwarz ve Ernst, 1996). Ayrıca, kekikteki ana bileşenler antioksidan aktiviteleri açısından incelenmiş ve çoğu bileşenin a-tokoferol’den bile daha güçlü bir etkisinin olduğu ortaya çıkmıştır (Miura ve Nakatani, 1989). Türkiye’de yetişen 6 çeşit kekik benzeri bitkinin antimikrobiyal özellikleri çalışılmıştır (Akgül ve Kıvanç, 1988). Türkiye florasında, endemik 16 türü bilinmektedir (Güner ve ark., 2000). Oregano bitkisi ziraat, eczacılık ve kozmetik endüstrilerinde, gıda ürünleri ve alkollü içkilerde lezzet verici olarak kullanılmaktadır (Şahin ve ark., 2004). Origanum vulgare L. uçucu yağının yüksek derecede antimikrobiyal ve antioksidan aktivitesine sahip olduğu tespit edilmiştir (Burt ve Reinders, 2003; Sartoratto ve ark., 2004; Capecka ve ark., 2005).

Esansiyel Yağlar : Defne Defne (Laurus nobilis L), Akdeniz ülkelerinde özellikle kıyı kesimlerde yetişen ağaçsı bir bitkidir. Defnenin uçucu yağı yüksek miktarda oksijenli bileşenler içerir. Uçucu yağının kompozisyonu birçok araştırıcı tarafından çalışılmıştır. İçeriğinde miktar olarak en çok 1,8- sineol daha sonra sırasıyla linalol, a-terpinil asetat ve a-pinen ve sabinen gibi birçok monoterpen hidrokarbon bulunmaktadır. Baharat tadını veren benzen bileşenleri (öjenol, metil öjenol ve elemisin) uçucu yağda %1-%12 arasında bulunmaktadır ve defne yapraklarına duyusal özellikleri veren en önemli maddelerdir (Borges ve ark., 1992; Biondi ve ark, 1993; Pino ve ark., 1993) . Defne taze ve kurutulmuş olarak ve uçucu yağ olarak et ve balık ürünleri ve çorbalarda lezzet verici olarak kullanılmaktadır. Ayrıca antimikrobiyal özelliklerinden dolayı gıda endüstrisinde koruyucu olarak kullanılmaktadır (Hammer ve ark., 1999). Laurus nobilis L. (Lauraceae), Akdeniz bölgesi ve Türkiye’de yetişmektedir (Kosar ve ark., 2005a). Uçucu yağ içeriğinden dolayı yaprakları eski çağlardan beri baharat olarak kullanılan bu bitki ülkemizde yabani olarak yetişmektedir (Akgül ve Kıvanç, 1989). Kuru defne yaprakları ve bunların uçucu yağları et, çorba, sos, şekerleme (Diaz-Maroto ve ark., 2002) ve balıkta (Bouzouita ve ark., 2001) lezzet arttırıcı olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, parfümeri ve sabun endüstrisinde (Kosar ve ark., 2005a) ve tıpta kullanılmaktadır (Kılıç ve ark., 2004). Defne uçucu yağının antimikrobiyal aktivitesi (Bouzouita ve ark., 2003; Dadalıoğlu ve Evrendilek, 2004) ve ayrıca antioksidan aktivitesi (Simic ve ark., 2003; Skerget ve ark., 2005) üzerine çalışmalar yapılmıştır. Bu nedenle defne, gıda endüstrisinde koruyucu olarak kullanılır (Kılıç ve ark., 2004).

Esansiyel Yağlar : Biberiye Biberiye (Rosmarinus officinalis L.), Ege ve Akdeniz bölgelerinde yetişen yapraklarından uçucu yağ elde edilen bir bitkidir. Biberiye ayrıca taze veya kurutulmuş olarak tüketilmektedir. Biberiye yağının ana bileşenleri -pinen, kamfen, 1,8-sineol, kamfor, borneol ve -terpineol’dur. Bu maddelerin çok güçlü antimikrobiyal özellikleri olduğu bilinmektedir (Tepe ve ark., 2005). Süperkritik akışkan ekstraksiyonu ile ekstrakt edilen biberiye, zencefil ve curcuma ekstraktları karşılaştırıldığında biberiyenin en yüksek antioksidan özelliğe sahip olmasına rağmen en düşük antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur (Leal ve ark., 2003). Gıda endüstrisinde kullanılan doğal antioksidanlar içinde biberiye ve adaçayı en yüksek antioksidan özelliğe sahiptir (Chipault ve ark., 1952). Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae), kozmetik, geleneksel ilaç yapımı ve gıdalara lezzet verici olarak kullanılmaktadır (Ramirez ve ark., 2006). Rosmarinus cinsinin en yaygın olarak bulunan (Pintore ve ark., 2002) ve Akdeniz bölgesinde doğal olarak büyüyen tek türüdür (Angioni ve ark., 2004). En önemli üreticileri Türkiye, İtalya, Dalmaçya, İspanya, Yunanistan, Mısır, Fransa, Portekiz ve Kuzey Afrika’dır (Atti-Santos ve ark., 2005). İthalat yapan en önemli ülkeler ise ABD, Japonya ve bazı AB ülkeleridir (Flamini ve ark., 2002). Biberiye’den en yüksek kalitede uçucu yağ yapraklarından elde edilir ve bu yağ et, salam ve soslar gibi çeşitli gıdalarda çeşni olarak kullanılır (Lo Presti ve ark., 2005). Aromatik özelliğinden dolayı, uçucu yağ parfümeride ve ayrıca dezenfektan ve böcek öldürücü bileşen olarak kullanılmaktadır (Lo Presti ve ark., 2005). Biberiye uçucu yağı antimikrobiyal ve antioksidan aktiviteye sahiptir (Baratta ve ark., 1998; Pintore ve ark., 2002; Saccheti ve ark., 2005).

Esansiyel Aromatik Yağlar : Uçucu yağ eldesi Bitkilerden uçucu yağları elde etmek için kullanılan konvansiyonel metodlar hidrodistilasyon, buhar distilasyonu ve çözgen ekstraksiyonudur. Buhar distilasyonu oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Distilasyon, sıvı karışım ve bundan oluşan buhar arasındaki kompozisyon farkına dayanan bir ayırma yöntemidir. Bu kompozisyon farkı etkin buhar basıncı ya da sıvı bileşenlerinin uçuculuk farkından kaynaklanmaktadır. Buhar distilasyonu kaynama noktası yüksek olan karışımları ayırmada ya da uçucu olmayan kısımlardan uçucu maddeleri ayırmada kullanılan özel bir yöntemdir. Bu yöntemde buharlaşma sıcaklığı buhar enjeksiyonu ile düşürülmektedir (Teranishi ve ark., 1977). Buhar kullanılmasının en önemli avantajı uçucu maddelerin suda kolaylıkla yoğunlaştırılabilmesidir (Krell, 1963). Ayrıca buhar atmosferik oksijenin yerine geçerek oksidasyonu engellemektedir (Ellerbe, 1979). Fakat bu metodda bitki yüksek sıcaklığa tabii tutulduğundan ısıya karşı hassas bileşenlerin bozulmasına neden olmaktadır. Ayrıca önemli miktarda uçucu bileşenlerin kaybı görülmektedir. Buhar distilasyonu ile kekikten uçucu yağ eldesinde öğütmenin, distilasyon süresinin ve buhar akış hızının yağ verimi ve bileşimi üzerindeki etkileri araştırılmıştır (Hancı ve ark., 2003). Klasik çözgen-ekstraksiyon metodunda uçucu olmayan uçucu yağlar da ekstrakt edilmektedir. Çözgen ekstraksiyon metodu çok uzun sürmektedir. Ayrıca, büyük miktarda organik çözgen kullanılması pahalı olmaktadır, çevrenin kirlenmesine sebep olmaktadır ve toksik çözgenin daha sonra tam olarak ortamdan uzaklaştırılamaması gıda endüstrisinde problem olmaktadır.

Konvansiyonel metodların uçucu bileşenlerin büyük ölçüde kaybolması, doymamış veya ester bileşenlerin ısıl ve hidrolitik etkilerle kaybolması, ekstraksiyon veriminin düşük olması ve toksik çözgen kullanılması gibi dezavantajları vardır (Ferhat ve ark., 2007). Ayrıca, bu metodlarda işlem süresi çok uzundur. Bu nedenle son yıllarda mikrodalga ve süperkritik akışkan ekstraksiyonu gibi çevre dostu metodlar geliştirilmeye başlanmıştır. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu çözgen ekstraksiyonuna göre daha etkin, güvenli ve çözgen tüketimi açısından daha ucuzdur. Kritik sıcaklıklarının üzerindeki bir sabit sıcaklıkta, kritik basınçlarının üzerinde bir basınca sıkıştırılarak elde edilen süperkritik akışkanların gaz benzeri aktarım özellikleri, basınç ve sıcaklığa bağlı olarak değişen güçlü (sıvı benzeri) ve seçici çözgen özellikleri, kalıntı bırakmamaları, onları sıvı çözgenlere göre daha avantajlı kılar. Işık, hava ve ısıdan etkilenen gıdaların ve biyolojik maddelerin ekstraksiyonunda, akışkan olarak düşük kritik sıcaklığı (31.2o C) ve basıncı (7.38 MPa), kalıntı düzeyinde toksik olmayışı, ucuz ve kolaylıkla elde edilebilmesi, ve yanıcı olmayışı nedeni ile daha çok karbon dioksit (SC-CO2) tercih edilmektedir. Çözünenlerin SC-CO2 içerisindeki çözünürlükleri molekül yapılarına bağlı olduğundan, her çözünenin belli sıcaklık ve basınçtaki çözünürlüğü farklıdır. Bunun sağladığı seçici ekstraksiyon yapabilme özelliği ile, kademeli azalan veya artan basınç (veya sıcaklık) altında ekstraksiyon yapılarak, toplam ekstraksiyondan sonra azalan basınçlarda birden fazla ayırıcı kullanılarak veya sabit sıcaklık ve basınçta yapılan ekstraksiyon süresince zamana bağlı olarak ürün toplanarak, değişik içerikli ve fonksiyonel özellikleri olan (antioksidan aktivitesi vb.) fraksiyonlar elde edilebilir. SC-CO2 daha çok yağ ve yağda çözünen apolar bileşenlerin ekstraksiyonunda başarı ile kullanılmaktadır. Suda çözünen polar bileşenlerin SC-CO2 ile ekstraksiyonu ise, SC-CO2 in çözgen gücü ve/veya seçiciliği polar organik sıvı çözgenler (%5-10 oranında etanol, vb.) eklenip arttırılarak mümkün olmaktadır (King ve Bott, 1993).

SC-CO2 ekstraksiyonunun en yaygın olarak kullanıldığı alanlardan biri bitkilerdir. Bu çalışmalar arasında nane (Özer ve ark., 1996; Ammann ve ark., 1999), kekik -Thymbra spicata (Sonsuzer ve ark., 2004) –Origanum vulgare L. (Simandi ve ark., 1998; Diaz-Marato ve ark., 2002; Rodrigues ve ark., 2004; Gaspar ve Leeke, 2004), biberiye (Ibanez ve ark., 1999; Leal ve ark., 2003), zencefil, curcuma (Leal ve ark., 2003), adaçayı, kişniş (Catchpole ve Grey, 1996), fesleğen (Reverchon ve ark., 1994) ekstraksiyonu vardır. Uçucu bileşenleri uçucu olmayanlara göre seçici olarak elde etmek için genellikle düşük SC-CO2 yoğunluğu tercih edilmektedir. Düşük yoğunlukta (40-50o C, 80-90 bar) terpenler parafinlere ve yağ asitlerine göre SC-CO2 içerisinde çok daha iyi çözünürdür. Diğer gruplar belirgin bir çözünürlük göstermezler. Yüksek yoğunlukta (40-50o C, 100-200 bar) terpenler ve oksijenli terpenler, SC-CO2 içerisinde tamamen çözünürken diğer istenmeyen bileşiklerin içeriği de artmaktadır (Reverchon, 1997). Kekik yağının SC-CO2 ekstraksiyonu sırasında basınç kademeli olarak (80-120-200-300 bar) arttırılarak elde edilen fraksiyonların uçucu yağ oranları düşmüştür (Simandi ve ark.,1998). Bununla beraber, biberiyenin iki kademeli ekstraksiyonu sırasında ilk fraksiyonun (40o C, 100 bar, 30 dak.) uçucu yağlarca zengin, andioksidan aktivitesinin düşük, ikinci fraksiyonun (60o C, 400 bar, 30-60 dak) ise uçucu yağ içeriğinin düşük ama antioksidan aktivitesinin yüksek olduğu gözlenmiştir (Ibanez ve ark., 1999). SC-CO2 ekstraksiyonu ile elde edilen antioksidanların aktivitelerinin çözgen ekstraksiyonu ile elde edilenlere göre daha yüksek olduğu bildirilmişitr (Ibanez ve ark., 1999) Buhar distilasyonu ile karşılaştırıldığında SFE metodunda verim (Simandi ve ark.,1998) ve hızın (Ammann ve ark., 1999) düşük olmasına karşın, sıcaklığa hassas bileşenlerin bozulmasının, suda çözünür veya suya hasas bileşenlerin hidrolizinin önlendiği tespit edilmiştir. SC-CO2 ekstraksiyonunu ile elde edilen biberiye (Reverchon, 1997) ve kekik yağlarının (Ondarze ve Sanchez, 1990) buhar distilasyonu ile elde edilene göre daha çok oksijenli bileşik içerdiği görülmüştür.

Konvansiyonel metodlara bir başka alternatif, çözgen ekstraksiyon yöntemi ile mikrodalga enerjisinin birleştirilmesidir. Bu metodun en önemli avantajı ekstraksiyon süresinin kısalmasıdır. Konvansiyonel ısıtmada önce çözgenin içinde bulunduğu kap ısıtılmakta ve daha sonra bu ısı çözeltiyi ısıtmaktadır. Ancak mikrodalga kullanıldığında çözelti doğrudan ısınmaktadır ve ısınma çok hızlı olmaktadır. Ayrıca, bu yöntem ile daha az miktarda çözgen kullanılmaktadır (Eskilsson ve Björklund, 2000). Çözgen ekstraksiyonunda işlem süresi 3-48 saat sürmekte ve 100-500 ml çözelti kullanılmakta iken mikrodalga kullanıldığında ise işlem süresi 3-30 dakika sürmekte ve 10-40 ml çözgen kullanılmaktadır. Mikrodalganın maddeleri etkili bir şekilde ısınma özelliği olmasına rağmen mikrodalga fırınlar ancak son yıllarda ekstraksiyon amaçlı kullanılmaya başlanmışlardır. Magnetron yardımıyla mikrodalga fırının içinde bir elektrik alanı oluşmaktadır. Polar ve iyonik moleküller bu elektrik alanıyla karşılaştığında hareketlenmekte ve bu moleküllerin elektrik alanı boyunca dizilmeye çalışırken birbirleriyle de çarpışmaları sonucu olarak ısı oluşmaktadır (Buffler, 1993). Bir çözgenin mikrodalgayı absorplaması dielektrik özelliklerine bağlıdır. Polar moleküllerin ve iyon çözeltilerin dielektrik kayıp faktörü yüksek olduğu için mikrodalgayı güçlü bir şekilde absorplamakta ve hızlı bir şekilde ısınmaktadırlar. Mikrodalga-çözgen ekstraksiyonu kapalı ve açık sistemlerde gerçekleştirilebilir. Kapalı sistemler kullanıldığında çözgen basınç altında kaynama noktasının çok üstünde ısıtılmakta ve ekstraksiyon verimi ve hızı artmaktadır. Çözgen çeşidi, çözgen miktarı, sıcaklık, fırın gücü, ekstraksiyon süresi, gıdanın su miktarı ve matris özellikleri mikrodalga-çözgen ekstraksiyonda düşünülmesi gereken parameterelerdir (Eskilsson ve Björklund, 2000). Mikrodalga çözgen ekstraksiyonu son yıllarda yağlı tohumların, peynir, süt, kızartılmış ürünlerin (Garcia-Ayuso ve ark., 1999a; 1999b; 2000; Luque-Garcia ve ark., 2002), biberiye ve nanenin ekstraksiyonunda (Chen ve Spiro, 1994) kullanılmıştır.

2004 yılında çözgensiz mikrodalga ekstraksiyon yöntemi geliştirilmiştir (Lucchesi ve ark., 2004a; 2004b). Çözgensiz mikrodalga ekstraksiyonu (ÇME), atmosferik basınçta distilasyonun mikrodalga ısıtmayla gerçekleştirilmesidir. Bu yöntemde bitki çözgen içermeyen mikrodalga reaktörüne yerleştirilir. Mikrodalga ile ısıtma ile bitkinin içerisindeki uçucu yağ serbest kalmakta ve buharlaşmaktadır. Ayrılan uçucu bileşenler mikrodalga fırının dışındaki soğutma sistemi ile yoğunlaşmaktadırlar. Bu method, işlem süresinin kısa olması, enerjiden tasarruf edilmesi, çözgen gerektirmemesi ve çevreye zarar vermemesi nedeniyle aroma bitkilerinden uçucu yağın ekstraksiyonu için mükemmel bir alternatiftir. Konvansiyonel metodlarla karşılaştırıldığında değerli uçucu yağ eldesi ve enerji tasarrufu gibi avantajları vardır. Bu yeni yöntem ile değişik bitkilerden uçucu yağlar ekstrakt edildiğinde oksijenli bileşenler hidrodistilasyona göre yüksek miktarda ve yağ içinde bulunması istenmeyen monoterpenler düşük miktarda elde edilmiştir (Lucchesi ve ark., 2004a; 2004b). ÇME metodu ile uçucu yağ eldesinde Lucchesi ve ark., (2004a) ajowan, kimyon ve star anise bitkileri; Lucchesi ve ark., (2004b) fesleğen, bahçe nanesi ve kekik; (Lucchesi ve ark., 2007) kakule üzerinde çalışmıştır.

Mikrodalga yardımlı hidrodistilayon (MYH) (Stashenko ve ark., 2004a ve 2004b) ısıya karşı hassas bileşenlerin ekstraksiyonunu için geliştirilmiş bir başka yeni teknolojidir. Bu metodda, kuru bitki belirli bir miktarda su ile birlikte Clevenger düzeneğine konulur, ısıtma mikrodalga enerjisi ile yapılır. Bu nedenle işlem süresi çok kısadır. ÇME metodunda, kullanılan su miktarı sınırlıdır, taze bitki kullanılırsa herhangi bir çözgen ya da su eklenmesine gerek yoktur. Kuru numune kullanıldığında ise işlem öncesi numune suda bekletilerek suyu emmesi sağlanır, daha sonra suyun fazlası süzülür. Literatürde MYH’nin uçucu yağ eldesinde kullanıldığı çalışmalara örnekler şu şekilde sıralanabilir: Lippia alba (Mill.) N.E. Brown (Stashenko ve ark., 2004a), Columbian Xylopia aromatica (Lamarck) (Stashenko ve ark., 2004b), Salvia triloba L. ve Laurus nobilis L. (Kosar ve ark., 2005a), Anethum graveolens L. ve Coriandum sativum L. (Kosar ve ark., 2005b), Lavandula angustifolia (Iriti ve ark., 2006) ve Heracleum crenatifolium Boiss., H. platytaenium Boiss., ve H. sphondylium L. subsp. ternatum (Velen.) Brummit (Özek ve ark., 2005). Daha güvenli ve doğal gıdalara olan ilgi gün geçtikçe arttığı için uçucu ya da eterik yağ olarak da bilinen uçucu yağların kullanımının artması beklenmektedir. Genel olarak uçucu yağlar antimikrobiyal ve antioksidan aktiviteye sahiptir ve ayrıca içerdikleri bileşenlere bağlı olarak antifungal, antiviral, antimikotik, antiparasitik ve böcek öldürücü özellikler de taşıyabilirler. Bu kadar değerli olan uçucu yağların üretim teknolojisinin iyileştirilmesi ürün verimi ve kalitesinin arttırılması için gereklidir.

Esansiyel Yağlar : Deneylerde kullanılan kuru haldeki baharatlar (Origanum vulgare L., Laurus nobilis L. ve Rosmarinus officinalis L.) Kütaş Tarım Ürünleri Dış Tic. San. A.Ş.’den elde edilmiştir. Uçucu yağlardaki bileşenlerin kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmesinde kullanılan standart maddeler α-pinen, β-mirsen, γ-terpinen, metil öjenol, p-simen, kuminaldehid (Fluka, Ronkonkoma, NY, ABD), β-ödesmol, izopulegol, verbenon (Fluka, Tokyo, Japonya), α- humulen, 3-karen, 4-terpineol, bornil asetat, terpinolen, fenkol, öjenol (Fluka, Buchs, İsviçre), limonen, mirtenal, o-simen (Fluka, Neu-Ulm, Almanya), β-karyofilen (Fluka, Madrid, İspanya), borneol, α-terpineol, kamfor, β-pinen, 1,8-sineol, linalol, timol, karvakrol, metil jasmonat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya) and kamfen (Supelco, Bellefonte, PA, ABD)’dir. Kekik yağındaki bileşenlerin kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmesinde ayrıca ise timol, karvakrol, p-simen, 4-terpineol, α-pinen, β-mirsen, α-terpinen, γ-terpinen, β-karyofilen ve 1-okten-3-ol içeren standart karışım kullanılmıştır (Supelco, Bellefonte, PA, ABD). Nonan (internal standard) Fluka’dan satın alınmıştır (Buchs, İsviçre). Susuz sodyum sülfat Riedel-de Haën (Seelze, Almanya)’den etilalkol ise Merck (Darmstadt, Almanya)’den alınmıştır. Antioksidan aktivite tayini için kullanılan DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, D9132), linoleik asit (L1376), fosfat tamponu (P4417), hemoglobin (H2500), FeCl2 (372870), metanol Sigma- Aldrich’den, ABTS [2-2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] Diammonium salt (11557) Fluka’dan, amonyum tiyosiyanat Merck’ten satın alınmıştır. Çalışmada antimikrobiyal aktivite tayini için patojen kültür olarak Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji Laboratuvarından temin edilen Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes Scott-A, Salmonella typhimurium NRRL E 4463 ve Staphylococcus aureus 6538P kültürleri kullanılmıştır.

Esansiyel Yağlar : Hidrodistilasyon Konvansiyonel hidrodistilasyon Clevenger düzeneğinde yapılmıştır. Kekik ve defne ile yapılan deneylerde kuru bitki:su oranı 1:10 iken biberiye kullanıldığında bu oran 1:7 olmuştur. İşlem farklı sürelerde yapılmış ve işleme numunede uçucu yağ kalmayana kadar (kekikte 3 saat) devam edilmiştir. Her bir koşul için deneyler iki kez tekrarlanmıştır. Farklı sürelerin sonunda toplanan uçucu yağ amber renkli şişelere konulmuş, susuz sodyum sülfat ile suyu alınmış, nitrojen altında kapatılarak analiz edilene kadar 4C’de saklanmıştır.

Esansiyel Yağlar : Çözgensiz Mikrodalga Ekstraksiyonu (ÇME) ÇME düzeneği için 2450 MHz’de çalışan mikrodalga fırın (White-Westinghouse, Pittsburg, ABD) kullanılmıştır. Fırının IMPI-2L testi ile ölçülen en yüksek gücü 622 W’dır (Buffler, 1993). Mikrodalga gücünün etkisini anlamak için kekik deneylerinde dört güç seviyesi kullanılmıştır: % 100 (622W), % 80 (498 W), % 60 (373 W) ve % 40 (249 W). Defne ile yapılan deneylerde iki farklı gücün (622W ve 249 W) etkisi çalışılmıştır. Fırının iç boyutları 29 х 37 х 40 cm’dir. Düz tabanlı, 1000 mL kapasiteli cam balon fırının içerisine konularak fırının tepesinden açılmış olan delikten Clevenger düzeneğine bağlanmıştır. Deliğin etrafı polytetrafloraetilen (teflon) ile kapatılarak mikrodalganın etrafa sızması önlenmiştir. Şekil 1’de kullanılan deney düzeneği görülmektedir. ÇME için, 50 g kuru Origanum vulgare L. 700 mL saf su içinde oda sıcaklığında 1 saat bekletilmiş ve böylece bitkinin suyu emmesi sağlanmıştır. Laurus nobilis L. kullanıldığında 150 g bitki 700 mL oda sıcaklığındaki saf su içerisinde 1 saat bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda fazla su süzülerek nemlenmiş olan bitki cam balona konulmuş ve fırın istenilen güçte çalıştırılarak ekstraksiyon işlemi başlatılmıştır. Ekstraksiyon işlemi farklı sürelerde yapılmış ve işleme numunede hiç uçucu yağ kalmayana kadar devam edilmiştir. Ekstraksiyon sonunda toplanan yağın hacmi ölçülmüştür. Her bir koşulda deneyler 3 kez tekrarlanmıştır. Uçucu yağlar amber renkli şişelere konulmuş, susuz sodyum sülfat ile suyu alınmış, nitrojen altında kapatılarak analiz edilene kadar 4ºC’de saklanmıştır.

Uçucu Yağ Üretim Prosesi

Şekil 1. ÇME ve MYH için deney düzeneği

Mikrodalga Yardımlı Hidrodistilasyon (MYH) Biberiye kullanıldığında ÇME olumlu sonuç vermediği için bu bitkide MYH’nin etkisi çalışılmıştır. MYH için de aynı düzenek kullanılmış ve iki farklı mikrodalga gücünün (622W ve 249 W) etkisi çalışılmıştır. Biberiyenin konvansiyonel hidrodistilasyon deneylerinde olduğu gibi MYH deneylerinde de kuru bitki:su oranı 1:7 olmuştur (50 g kuru Rosmarinus officinalis L., 350 g saf su karışımı). Ekstraksiyon işlemi farklı sürelerde yapılmış ve işleme numunede hiç uçucu yağ kalmayana kadar devam edilmiştir. Ekstraksiyon sonunda toplanan yağın hacmi ölçülmüştür. Her bir koşulda deneyler iki kez tekrarlanmıştır. Uçucu yağlar amber renkli şişelere konulmuş, susuz sodyum sülfat ile suyu alınmış, nitrojen altında kapatılarak analiz edilene kadar 4ºC’de saklanmıştır.

Süperkritik Karbon Dioksit Ekstraksiyonu Süperkritik karbon dioksit ekstraksiyonları ISCO firmasına ait SFX 5100 model süperkririk akışkan ekstraksiyon cihazı kullanılarak yapılmıştır. Cihaz 103.4-689.7 bar (1500-10000 psia), 25-150o C aralığında çalışmaktadır. Ekstraksiyonlar sırasında, 0.3 gr numune 10 ml lik kartuşlara (ekstraktör) konulmuş, karbon dioksit akış hızı 2 gr/ml olarak sabit tutulmuştur. Restriktör sıcaklığı 100o C ve ekstrakt toplama sıcaklığı ise -5o C olarak belirlenmiştir. Ekstraktörün giriş ve çıkışında gözenek büyüklüğü 2 m olan çelik filtreler kullanılmıştır. Kekik, defne ve biberiye 105 bar, 40o C ve 30 dakika süre ile ekstraksiyona tabii tutulmuş, ekstraksiyon verimleri ve elde edilen yağların içerikleri belirlenmiştir. Bunun yanı sıra kekik yağının 103.4 bar, 40o C de 0-10, 10-20, 20-30 dakika aralıklarında toplanan fraksiyonlarının içerikleri, aynı basınç ve sıcaklıkta 30 dakikalık ekstraksiyon ile elde edilen yağın içeriği ile karşılaştırılmıştır. Süperkritik karbon dioksit ekstraksiyonu ile edilen defne yağındaki oksijenli bileşikler ve monoterpen hidrokarbonlarının basınç ve sıcaklık ile değişimi incelenmiştir.

Analiz Parçacık boyut dağılımı Parçacık boyut dağılımı elek analizi yapılarak gerçekleştirilmiştir. Bir grup elek otomotik çalkalayıcı üzerine yerleştirilmiştir. En geniş deliğe sahip elek (8 mm) en üste ve en dar deliğe sahip elek (425 mikron) en alta konulmuştur. Diğer elek delik boyutları, 4 mm, 2 mm, 1 mm ve 850 mikrondur. En alta tava konulmuştur. Analiz için Origanum vulgare L. bitkisinde 50 g, Laurus nobilis L. ve Rosmarinus officinalis L. bitkilerinde 100 g numune kullanılmış, numune en üsteki eleğe yerleştirilmiş ve 30 dakika boyunca çalkalanmışlardır. İşlem bittikten sonra herbir elekte kalan parçacıklar tartılmış ve kütle fraksiyonları hesaplanmıştır. Ortalama Sauter çapı aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır

Verim Uçucu yağ verimi toplanan yağın hacminin kullanılan bitkinin ağırlığına bölünmesiyle hesaplanmıştır ve mL yağ/g kuru bitki olarak ifade edilmiştir.

Uçucu yağ bileşenlerinin tanımlanması ve kantitatif olarak analizi Farklı koşullarda elde edilen uçucu yağlar gaz kromatografi (Agilent Technologies 6890N Network GC System, Palo Alto, CA, US) ve gaz kromatografi-kütle spekrometre cihazı (Agilent Technologies 5973 Network Mass Selective Detector, Palo Alto, CA, US ile bağlanmış olan Agilent Technologies 6890N Network GC Sistemi) ile analiz edilmiştir. MSD ile bileşenlerin karakterizasyonu yapılırken aynı zamanda FID ile kantitatif analiz yapabilmek için iki kolon iki delikli ferrül ile bağlanmıştır. Bu şekilde enjeksiyon tek enjeksiyon bloğundan yapılmıştır. Analizlerde sabit fazı % 5 fenil metil silokzan olan HP-5MS (30mº 0.25mm º 0.25μm) iki adet kapiler kolon kullanılmıştır.

Kekik yağı için GC-MS şartları şu şekildedir: Taşıyıcı gaz, He; akış modu sabit hız, akış hızı MSD’ye bağlı kolonda 1 mL/dak, FID’ye bağlı kolonda 0,6 ml/dak; splitles; enjeksiyon hacmi 1μm; enjeksiyon sıcaklığı 250ºC; fırın sıcaklık programı: 50ºC’den 150ºC’e 3ºC/dak ile çıkış, 150ºC’da 10 dakika bekleme ve daha sonra 10ºC/dakika hızda 250ºC’a çıkış şeklindedir; MSD transfer hattı sıcaklığı, 250ºC; MSD kuadrapol sıcaklığı, 150ºC; iyonizasyon sıcaklığı, 230ºC; MSD için iyonizasyon modu, 70 eV’de electronik çarpışma; çözgen gecikmesi 4 dak.

Defne yağı için GC-MS şartları şu şekildedir: Taşıyıcı gaz, He; akış modu sabit hız; akış hızı, MSD’ye bağlı kolonda 1.2 mL/dak; FID’ye bağlı kolonda 0.8 mL/dak; splitles; enjeksiyon hacmi, 1 μL; enjeksiyon sıcaklığı 250ºC; fırın sıcaklık programı: 60ºC’de 5 dakika tutma, 60ºC’den 210ºC’e 2ºC/dak ile çıkış şeklindedir; MSD transfer hattı sıcaklığı, 230ºC; MSD kuadrapol sıcaklığı, 150ºC; iyonizasyon sıcaklığı, 230ºC; iyonizasyon modu, 70 eV’de electronik çarpışma; çözgen gecikmesi 4.5 dak.

Biberiye yağı için GC-MS şartları şu şekildedir: Taşıyıcı gaz, He; akış modu sabit hız; akış hızı MSD’ye bağlı kolonda 0.8 mL/dak, FID’ye bağlı kolonda 0.4 mL/dak; splitles; enjeksiyon hacmi, 1 μL; enjeksiyon sıcaklığı 250ºC; fırın sıcaklık programı, 50ºC’de 2 dakika tutma, 50ºC’den 225ºC’e 3ºC/dak ile çıkış şeklindedir; MSD transfer hattı sıcaklığı, 250ºC; MSD kuadrapol sıcaklığı, 150ºC; iyonizasyon sıcaklığı, 230ºC; iyonizasyon modu, 70 eV’de electronik çarpışma; çözgen gecikmesi 4.5 dak.

Esansiyel Yağlar Uçucu yağ bileşenleri, standartların kolonda alıkonma süreleri ile karşılaştırılarak ve kütle spekrometresinin kütüphanesi (NIST98, Wiley7n, Flavor2) ile eşleştirilerek tanımlanmıştır. Verilerin analizi için MSD ChemStation (G1701 DA D.02.00.275) yazılımı kullanılmıştır. Kantitatif analiz internal standart metodu ile GC-FID’ de gerçekleştirilmiş, internal standart olarak nonan kullanılmıştır.

Origanum vulgare L. uçucu yağının kantitatif analizinde, eksternal standart olarak timol, karvakrol, p-simen, 4-terpineol, α-pinen, β-mirsen, α-terpinen, γ-terpinen, β-karyofilen ve 1- okten-3-ol kullanılmıştır. İnternal standardın konsantrasyonu sabit olmak üzere (229,668 ppm) 7 farklı konsantrasyonda eksternal standartlar kullanılarak hazırlanmış ve kekik uçucu yağlarının analizinde kullanılan metodla kolona enjekte edilmiştir. Meydana gelen kromatogramlardan yukarıda adı geçen her bileşen için bir kalibrasyon eğrisi çıkarılmış ve bu eğriler ait oldukları bileşenlerin kekik yağı içerisindeki konsantrasyonlarının hesaplanmasında kullanılmıştır. Kekik yağında eksternal standartlar dışında bulunan bileşenlerin konsantrasyonları ise Schoenmakers ve ark. (2000)’nın hipotezinden yola çıkılarak hesaplanmıştır. Schoenmakers ve ark. (2000) FID’nin belli bir bileşen sınıfı içinde çoğu bileşen için sabit bir hassasiyet faktörü gösterdiğini belirtmişlerdir. Buna göre her bir bileşen sınıfı için tek bir hassasiyet faktörü kullanarak o sınıf içerisindeki diğer bileşenlerin miktarları hesaplanabilir. Bu hipotezden yola çıkarak kekik yağında tespit edilen monoterpen hidrokarbonlar, fenoller, alkoller ve seskiterpenler için sırasıyla α-terpinen (~1.24), timol (~1.26), 1-okten-3-ol (~1.53) ve β-karyofillen (~1.26) nispi hassasiyet faktörleri kullanılmıştır. 3-oktanon (keton) ise hassasiyet faktörünün 1 olduğu varsayımı ile hesaplanmıştır. Laurus nobilis L. uçucu yağının kantitatif analizinde eksternal standart olarak öjenol, γ- terpinen, kuminaldehid, 1,8-sineol, β-pinen, p-simen, β- karyofilen, bornil asetat, metil öjenol, α-pinen, linalol, α-terpineol, mirtenal, 4-terpineol, kamfor , β-ödesmol kullanılmış, bu bileşenleri içeren kalibrasyon çözeltilerinden 7 farklı konsantrasyonda hazırlanmıştır. İnternal standard olarak yine nonan kullanılmıştır. Meydana gelen kromatogramlardan yukarıda adı geçen her bileşen için bir kalibrasyon eğrisi çıkarılmış ve bu eğriler ait oldukları bileşenlerin defne yağı içerisindeki konsantrasyonlarının hesaplanmasında kullanılmıştır. Diğer bileşenlerin kantitatif analizinde Schoenmakers ve ark. (2000)’nın yaklaşımı kullanılmıştır. Bu yaklaşıma göre Laurus nobilis L. uçucu yağında bulunan monoterpen hidrokarbonlar, fenoller, alkoller, ketonlar, aldehidler, esterler, eterler ve seskiterpenler, göreceli olarak β- pinen (~1.23), öjenol (~1.48), 4-terpineol (~1.43), kamfor (~1.34), mirtenal (~1,18), bornil asetat (~1.6), 1,8-sineol (~1.46) and β- karyofillen (~1.26), nispi hassasiyet faktörleri kullanılarak hesaplanmıştır. Laktonlarda β-karyofillen (seskiterpen)’in nispi hassasiyet faktörü kullanılmıştır.

Rosmarinus officinalis L. uçucu yağının kantitatif analizinde eksternal standart olarak γ-terpinen, metil jasmonat, verbenon, 1,8-sineol, β-pinen, p-simen, β-karyofillen, bornil asetat, metil öjenol, karvakrol, 4-terpineol, kamfor and fenkol kullanılmıştır. Diğer bileşenlerin kantitatif analizinde yine Schoenmakers ve ark. (2000)’nın yaklaşımı kullanılmıştır. Bu yaklaşıma göre Rosmarinus officinalis L. uçucu yağında bulunan monoterpen hidrokarbonlar, fenoller, alkoller, ketonlar, esterler, eterler ve seskiterpenler, göreceli olarak β-pinen (~0.943), karvakrol (~1.073), 4-terpineol (~1.092), kamfor (~1.059), bornil asetat (~1.245), 1,8-sineol (~1.068) and β-karyofillen (~0.935) nispi hassasiyet faktörleri kullanılarak hesaplanmıştır. Zhu ve ark. (2005) aldehidlerin nispi hassasiyet faktörlerinin ketonlarınkine çok yakın olduğunu bulduklarından aldehidlerde kamfor’un nispi hassasiyet faktörü kullanılmıştır.

Esansiyel Yağlar : Antioksidan aktivite Antioksidan aktivite iki farklı radikal ve linoleik asit oksidasyonu yöntemi kullanılarak saptanmıştır.

a) Güçlendirilmiş ABTS Radikal Katyonu Yöntemi: Yöntem, güçlü bir radikal olan ABTS.+ katyonu (2,2’-azinobis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ile oluşturulan oksidasyonun ortamdaki antioksidan bileşikler tarafından inhibisyonuna ve buna bağlı olarak gelişen renkteki açılmanın spektrofotometrik olarak ölçülmesi prensibine dayanmaktadır (Re ve ark. 1999). ABTS radikal katyonu, 2.45 mM potasyum persülfat çözeltisi ile ABTS stok çözeltisinin reaksiyona sokulması ve oda sıcaklığında 12-16 s bekletilmesi ile elde edilmiştir. Bu çözelti uygun konsantrasyon elde edilecek şekilde etanolle seyreltilmiştir. Örneğin ABTS radikalini inhibisyon kapasitesi elde edilen çözelti ile reaksiyona sokulduktan sonra 734 nm’de 5. dakikada absorbans ölçülerek saptanmıştır. % İnhibisyon aşağıdaki formülle hesaplanmıştır; İnhibisyon (%)= 1 – ( A örnek / A100) X 100

Aörnek: Örnek için okunan absorbans
A100: Etanolle seyreltilmiş ABTS çözeltisi için okunan absorbans

b) DPPH Radikaline Karşı Antiradikal Aktivite Ölçümü: DPPH (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil) stabil serbest bir radikaldir. Etanol veya metanolde çözünerek, mavi-viyolet renk verir. Ortamda radikal tutucu olduğunda DPPH sarı renkli 1,1-difenil-2-pikrilhidrazine dönüşür. Örneklerin DPPH radikalini inhibe etme kapasiteleri Braca ve ark. (2001)’nın yöntemine göre çalışılmıştır. Örnekten alınan 50 µL üzerine 950 µL DPPH (0.030 mg DPPH/mL metanolde çözünmüş) eklendikten sonra oda sıcaklığında gerçekleşen reaksiyonun 5. dakikasında 515 nm de absorbans okunur. Metanol ile sıfırlanan spektrofotometre de DPPH çözeltisinin absorbansı kontrol absorbans olarak kayıt edilir. Radikal aktivitenin inhibisyon yüzdesi şu şekilde hesaplanır; İnhibisyon (%)= 1 – ( Aörnek / Akontrol) X 100

Aörnek: Örnek için okunan absorbans
Akontrol : DPPH çözeltisi için okunan absorbans

c) Linoleik Asit Oksidasyonu Yöntemi: Linoleik asit peroksidasyonunun inhibisyonu Kuo ve ark. (1999) tarafından önerilen yöntemle saptanmıştır. Yöntem hemoglobin ile katalizlenen linoleik asit peroksidasyonunun inhibisyon derecesinin ölçülmesi prensibine dayanmaktadır. 10 µl örnek, % 0.05 Tween 20 ve 4 mM linoleik asit içeren 0.05 M fosfat tamponuna (pH 7.0) eklenmiş ve karışımın 37°C’de 3 dak. dengeye gelmesi beklenmiştir. Linoleik asidin peroksidasyonu karışıma % 0.035’lik hemoglobin çözeltisinden 20 µl eklenerek başlatılmıştır. Karışım daha sonra 37°C’de çalkalamalı su banyosunda (100 rpm) 10 dak. inkübe edilmiş ve 10 dakikanın sonunda reaksiyon % 0.6 HCl (etanolde) çözeltisi ile durdurulmuştur. Reaksiyon sonunda oluşan hidroperoksitler ferik tiyosiyanat yöntemi ile saptanmıştır. Örneklerin inhibisyon kapasiteleri aşağıdaki formülle hesaplanmıştır; İnhibisyon (%)= [ 1 – (Aörnek – A0) / (A100 – A0)] X 100

A0: Hemoglobin eklenmemiş örnek için okunan absorbans (480 nm)
A100: Örnek eklenmemiş çözelti için okunan absorbans (480 nm)
A örnek: Örnek için okunan absorbans (480 nm)

Antimikrobiyal aktivite Antimikrobiyal aktivitenin saptanması amacıyla kullanılan patojen kültürlerin geliştirilmesi için Trypton Soya Broth (TSB, Oxoid CM 129), kültürlerin sayımı için ise Plate Count Agar (Oxoid CM 325) kullanılmıştır. Analiz öncesinde patojen kültürler TSB besiyerlerine öze ile inokule edilmiş ve 35°C’de 24 saat inkübe edilerek taze kültürler hazırlanmıştır. TSB’de hazırlanan 18-24 saatlik taze patojen kültürlerden 0.1 ml inokulum alınarak steril petri kaplarına aktarılmış ve üzerine 45-50°C’deki su banyosunda tutulan Nutrient Agar (NA, Oxoid CM0003) besiyerinden yaklaşık 20 ml dökülüp inokulum ve besiyerinin karışması sağlanmış ve katılaşmaları için oda sıcaklığında beklenmiştir (Harris ve ark., 1989; Özbaş ve Aytaç, 1996). Antimikrobiyal aktivitenin saptanması amacıyla “kağıt disk” yöntemi uygulanmış ve bu amaçla 6mm çapında steril kurutma kağıtları kullanılmıştır. Steril kurutma kağıtlarına aseptik olarak 10 μl uçucu yağ emdirilmiş ve yukarıda anlatıldığı şekilde patojen bakterilerle inokule edilen NA besiyerine eşit aralıklarla ve her bir petride üç filtre kağıdı olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kontrol amaçlı olarak steril saf su kullanılmıştır. Petriler oda sıcklığında 1 saat bekletildikten sonra 37°C’de 24 saat inkübasyona bırakılmış ve bu süre sonunda inhibisyon zonlarının oluşumu gözlenmiştir (Özbaş ve Aytaç, 1996). Tüm denemeler paralel petrilerle ve üç tekerrürlü olarak yapılmıştır.

İstatiksel analiz Verim ve oksijenli bileşenler, monoterpen hidrokarbonlar ve seskiterpenler şeklinde gruplandırılan uçucu yağ bileşenleri istatistiksel olarak varyans analizi kullanılarak analiz edilmiştir. Verilerin normallik ve sabit varyans varsayımlarına uyup uymadığı kontrol edilmiştir. Normallik varsayımı Anderson-Darling testi kullanılarak kontrol edilmiştir. Eğer veriler varsayımları sağlamıyorsa Box-Cox transformasyonu uygulanmıştır. Değişik işlem şartları arasında fark bulunduğu zaman Tukey karşılaştırma metodu kullanılarak MINITAB yazılım programında veriler analiz edilmiştir. ÇME/ MYH ve hidrodistilasyon ile elde edilen uçucu yağların ABTS, DPPH ve linoleik asit peroksidasyonu yöntemleri için belirlenen antioksidan kapasiteleri ve Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes Scott-A, Salmonella typhimurium NRRL E 4463 ve Staphylococcus aureus 6538P üzerine antimikrobiyal etkileri SPSS yazılım programında tekyollu varyans analizi (One-Way Anova) ile kontrol edilmiştir. Farklılıklar Tukey karşılaştırma metodu ile belirlenmiştir.

PARÇACIK BOYUT ANALİZİ Kekik, defne ve biberiye yaprakları için parçacık boyut analizleri yapılmıştır. Sauter ortalama çapı kekik yaprakları için 1727.5 υm, defne yaprakları için 2103.4 υm, biberiye yaprakları için 1392.4 υm olarak hesaplanmıştır.

ÇÖZGENSIZ MİKRODALGA EKSTRAKSİYONU (ÇME) DENEYLERİ

Esansiyel yağlar : Kekik Uçucu yağ verimi Oregano yaprakları ÇME işlemi öncesinde saf su içerisinde 1 saat bekletilmiş ve bu sürenin sonunda fazla su süzülerek atılmıştır. Bu işlem sırasında kuru kekik tarafından emilen su miktarı kekiğin ilk ağırlığının yaklaşık olarak % 290’ı kadardır. Şekil 2’de zamana göre geleneksel hidrodistilasyon metodu ve farklı güçlerde mikrodalga ekstraksiyonu ile elde edilen yağ verimi değerleri gösterilmiştir. Verimin zamana bağlı değişimini gösteren grafikten de anlaşıldığı gibi mikrodalga gücü arttıkça yağ ekstraksiyon hızı artmaktadır. Bu durum, yüksek mikrodalga gücünde çalışıldığında ekstraksiyona tabii tutulan bitki maddesinin içerisinde daha yüksek basınç farkı oluşması, buna bağlı olarak da bitkinin içerisinde uçucu yağ bulunan keseciklerden yağın dışarı çıkışının daha hızlı gerçekleşiyor olmasıyla açıklanabilir. Farklı metodlar arasında en yüksek verime ulaşılma süreleri arasında farklılık vardır: bu süre konvansiyonel hidrodistilasyonda 3 saat iken ÇME’de 35 dakikaya kadar inebilmektedir. ÇME’de bu sürenin mikrodalga gücü azaldıkça arttığı gözlenmiştir (622 W da 35 dakika, 249 W’da 50 dakika). Bu gözlem, azalan mikrodalga gücü ile doğru orantılı olarak basınç farkının da azalacağı göz önünde bulundurulduğunda, yağın tamamının ekstraksiyonu için gerekli zamandaki artış beklentisini doğrulamaktadır. İşlem sonunda elde edilen en yüksek verim, %100 (622 W), % 80 (498 W), % 60 (373 W) ve % 40 (249 W) mikrodalga güçleri kullanıldığında sırasıyla 0.054, 0.053, 0.052 ve 0.049 mL yağ/g kekik, olmuştur. Hidrodistilasyonda ise yağ verimi 0.048 mL yağ/g kekiktir. Elde edilen en yüksek verim sonuçları karşılaştırıldığında işlemler arasında istatistiksel olarak fark olduğu görülmüştür (p≤0.05). Origanum vulgare L. bitkisinde ÇME metodu ile konvansiyonel hidrodistilasyon metoduna göre daha yüksek uçucu yağ verimi elde edildiği sonucuna varılabilir. Düşük mikrodalga güçlerinde ve hidrodistilasyon metodunda daha düşük verim elde edilmesi işlemin bu şartlarda daha uzun sürmesi ve bu nedenle uçucu maddelerin kaybolması ile açıklanabilir.

Kekik yağı

Şekil 2. Kekikte hidrodistilasyon ve farklı güçler kullanılarak mikrodalga ile yapılan ekstraksiyon işleminin uçucu yağ verimi üzerine etkisi (% 100 mikrodalga gücü a*,  % 80 mikrodalga gücü a, ▲ % 60 mikrodalga gücü ab , ● % 40 mikrodalga gücübc, □ konvansiyonelc ) * farklı harflere karşılık gelen ekstraksiyon şartları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardır, p≤0.05

Uçucu yağ kompozisyonu Bileşenlerin zamana bağlı değişimini görmek amacıyla, her iki yöntemde de (hidrodistilasyon ve çözgensiz mikrodalga ekstraksiyonu) ilk, orta ve son zamana denk gelen uçucu yağlar analize tabi tutulmuştur. Orta zamandan kasıt, maksimum verimin yaklaşık olarak yarısına ulaşıldığı zamandır. Şekil 3’de % 100 mikrodalga gücünde çalışılarak elde edilmiş kekik yağının GC-MS analizi sonucunda elde edilen toplam iyon kromatogramı görülmektedir.